Страница: 5/13
1. Сурамин, известный антагонист Р2 типа пуринорецепторов, уменьшал [Ca2+]i транзиенты, вызванные приложением 100 мкМ АТФ на 76% ± 7% и также не изменял концентрацию [Ca2+]i в покое. Данные представлены на рисунке 14.
|
|
При исследовании средних слоев неокортекса крыс мы обнаружили их способность отвечать на приложение АТФ. Таким образом мы можем сделать вывод о наличии в данном объекте пуринорецепторов. Ответ на АТФ является доза - зависимым с амплитудой половинного ответа в 220 нМ. Последовательные приложения АТФ, после второго приложения, не вызывали уменьшения амплитуды [Ca2+]in транзиентов. Из этого можно сделать вывод об отсутствии десенситизации данного типа рецепторов.
Исследуя источники повышения цитозольного кальция мы обнаружили, что АТФ активирует как ионотропные так и метаботропные рецепторы. Блокаторы потенциал - управляемых кальциевых каналов такие как кадмий, никель и верапамил уменьшали АТФ - индуцированные кальциевые транзиенты на 35% - 15%, что говорит об опосредованном АТФ активировании потенциал - управляемых каналов.
Для исследования активацию метаботропных рецепторов. Для этого мы прилагали АТФ в бескальциевом растворе, - амплитуда ответа при этом уменьшалась на 45% ± 7%. Этот результат говорит о том, что внутриклеточные депо принимают участие в генерации [Ca2+]in ответов, причем их вклад близок к половине. При повторных аппликациях АТФ в бескальциевом растворе Ca2+ ответ исчезал полностью после второй аппликации, т.е. внутриклеточные депо полностью истощаются. Исследуя путь высвобождения внутриклеточного кальция мы апплицировали тапсигаргин - спецефический блокатор АТФ - азы эндоплазматического ретикулума. [Ca2+]in транзиенты уменьшались на 63% ± 5% в присутствии тапсигаргина. Аппликация коффеина, агониста рианодиновых рецепторов, в клетках моторной коры 14 дневных крыс не вызывали повышения уровня [Ca2+]in . Следовательно выброс [Ca2+]in из внутриклеточного депо происходит по IP3 - чувствительному механизму.
Оптическая часть установки была смонтирована на базе микроскопа Axioskop, Zeiss. Разделение потоков возбуждающего света и флуоресценции производилось при помощи дихроического зеркала. Свет, прошедший через фильтр для возбуждения флуоресценции, отклонялся дихроическим зеркалом и при помощи высокоаппертурного иммерсионного объектива (40*, апертура 0.75) фокусировался на объекте. Флуоресцентный свет проходил через соответствующий интерференционный фильтр и подавался на фотоэлектронный умножитель (ФЭУ). Для уменьшения уровня шумов фиксированная диафрагма (1 мм) была расположена перед ФЭУ. В результате флуоресцентный сигнал собирался с фокальной плоскости диаметром 50 мкм, что позволило значительно улучшить соотношение сигнал/шум.
Модуль предварительной обработки позволял производить компенсацию автофлуоресценции и, при необходимости, усиливать сигнал, после чего он оцифровывался при помощи цифрового интерфейса TIDA и обрабатывался компьютером при помощи программ Tida 5.0 и Wintida, разработанных в Гейдельберге, Германия.
|
|
Рисунок 4. Принципиальная схема экспериментальной установки для двухволнового измерения кальция.
При работе со срезами все растворы готовились на основе раствора Тироде (в ммоль/л): NaCl - 125, KCl - 5.4, MgCl2 - 1, CaCl2 - 2.5, NaHCO3 - 26, KH2PO4 - 1.6, глюкоза - 10, постоянно аэрировавшийся газовой смесью 95% О2 + 5% СО2 (pH=7.4). Бескальциевый раствор готовился эквимолярной заменой CaCl2 на MgCl2 и добавкой 1 ммоль/л EGTA, растворы с повышенным содержанием калия или кофеина - заменой NaCl на соответствующее количество KСl или кофеина.
Реферат опубликован: 12/11/2009