Страница: 7/13
|
|
Для количественного определения концентрации кальция в пирамидальных нейронах моторной области новой коры использовался краситель Фура-2 AM (рисунок 2) (16).
|
|
На рисунке 3 представлен спектр зонда Фура -2 AM. При связывании с кальцием происходит характерное изменение спектра возбуждения этого красителя: при возбуждении светом с длиной волны 390 нм происходит уменьшение флуоресценции, а при возбуждении светом, с длиной волны 340 нм - увеличение. Однако, 340 нм является уже ультрафиолетовым светом, и для ее использования необходим микроскоп с кварцевыми линзами. Поскольку в нашем случае был использован обычный микроскоп, то вторая волна была выбрана длиной 390 нм. 360 нм - это изобестическая точка зонда Фура -2, т.е. флуоресцентный сигнал при возбуждении светом этой длины волны не зависит от концентрации Ca2+ и есть функция лишь концентрации зонда.
Измерение флуоресценции при возбуждении двумя длинами волн позволяет легко рассчитать [Ca2+]i в клетке по формуле (24):
[Ca2+]i= Kd * b * (R - Rmin)/(Rmax-R)
где Кd - константа диссоциации комплекса Фура -2 с кальцием, R=F360/F390 - текущее отношение флуоресцентных сигналов, Rmin = F360/F390|Ca0 - то же отношение в растворе с низкой концентрацией Ca2+, Rmax = F360/F390|CaҐ - то же отношение в растворе с высокой концентрацией Ca2+, b = F390|Ca0/F390|CaҐ - отношение флуоресцентных сигналов в низкой и высокой концентрации Ca2+ при возбуждении длиной волны 390 нм. Параметры Rmin, Rmax и b определяли экспериментально. Для этого были приготовлены базовый раствор (в ммоль/л) : KCl - 100, Tris-Cl - 10 (pH=7.2), Фура -2 - 0.005; раствор с низкой концентрацией Ca2+ готовился без добавления Ca2+ с добавкой EGTA - 10; раствор с высокой концентрацией Ca2+ - с добавкой CaСl2 - 10. Отношение величин флуоресценции определялось в каплях приведенных выше растворов, помещенных на дно экспериментальной камеры. В результате для нашей системы Rmin= 0.33, Rmax= 8.9 и b=12.8. Параметр Кd был взял из работы [Grinkiewicz et al, 1985] и равнялся 224 нмоль/л.
Для введения кальций - чувствительного зонда в клетку, срезы инкубировались в растворе Тироде, содержащим эстерифицированную незаряженную форму красителя Фура-2 ацетоксиметилэстер в концентрации 5 мкмоль/л, растворенную в диметилсульфоксиде с добавлением детергента Плуроник F-127 (0.02%). В такой форме краситель проникает в клетку, затем эндогенными эстеразами эфирные группы отщепляются, зонд становится заряженным и покинуть клетку не может. Окраска производилась 20 минут при температуре 35оС. Концентрация зонда в клетке определялась путем титрования окрашенных клеток раствором красителя, который добавлялся во внеклеточный раствор. Оцененная таким способом концентрация зонда в клетке была в диапазоне 30 - 70 мкмоль/л.
Принципиальная схема установки представлена на рисунке 4. Основными элементами ее являются: источник света, система смены фильтров, микроскоп, ФЭУ, модуль предварительной обработки сигнала и компьютер.
Источником возбуждающего света служит ртутная лампа мощностью 50 ватт. Поскольку в качестве кальций - чувствительного зонда использовали индикатор Фура -2 АМ, являющийся по возбуждению двухволновым (см. выше), то для количественного определения [Ca2+]i необходимо было одновременно индуцировать флуоресценцию обеими длинами волн. В нашей конфигурации периодическая смена фильтров возбуждения была реализована при помощи вращения колеса с вмонтированными в него двумя интерференционными фильтрами 360 и 390 нм. Частота вращения была 5 Гц. Управление системой смены фильтров осуществлялось при помощи кальций - измерительного модуля фирмы Luigs und Neumann, Германия. Этот же модуль являлся интерфейсом предварительной обработки.
Реферат опубликован: 12/11/2009